年诺贝尔生理学或医学奖授予杰弗理·霍尔（JeffreyCHall）、迈克尔·罗斯巴希（MichaelRosbash）、迈克尔·杨（MichaelWYoung）。
三位科学家的获奖理由是：因发现控制昼夜节律的分子机制。
获奖人简介：
杰弗里.霍尔（JeffreyC.Hall）
杰弗里.霍尔（JeffreyC.Hall），美国遗传学家，年出生于美国纽约。年在西雅图华盛顿大学获得博士学位，年至年在加州理工学院担任博士后研究员。年，他加入了布兰迪斯大学任教职。杰弗里.霍尔现已退休。
迈克尔·罗斯巴什（MichaelRosbash）
迈克尔·罗斯巴什（MichaelRosbash），美国遗传学家，年出生于美国堪萨斯城。他于年获得美国剑桥的麻省理工大学博士学位。后在苏格兰的爱丁堡大学做了三年博士后研究。年以来，在美国沃尔瑟姆的布兰迪斯大学任职。
迈克尔.杨（MichaelW.Young）
迈克尔.杨（MichaelW.Young），美国遗传学家，年出生于美国的迈阿密。年，他在奥斯丁的德克萨斯大学（UniversityofTexas）获得了博士学位。在至年间，他在PaloAlto的斯坦福大学担任博士后研究员。年后，他在纽约的洛克菲勒大学（RockefellerUniversity）任职。
生物的生命活动受内在生物节律调控
人体在一天中的不同生理活动也受生物钟调控
《知识分子》主编饶毅历时4年撰写两万字长文深度解读生物钟的分子研究历史，在十一长假与各位读者分享智力的愉悦。
勇气和运气：生物钟的分子研究
撰文｜饶毅（《知识分子》主编、北京大学讲席教授）
运气，外在而缥缈；
勇气，内生而实在。
运气不会寻找勇气；
勇气可能碰到运气。
在研究生物钟基因的过程中，事先难以预料能否取得突破，事后分析发现勇气足以成功，而运气是锦上添花，虽然花开的特别灿烂。
生物钟是生物体内周而复始的节律，如人们熟知的：动物的昼行夜伏、植物的春华秋实…。常见的近24小时昼夜节律（circadianrhythm）是典型的生物钟之一。
生物钟现象看似简单，其实不尽然。人们熟知的向日葵朝向太阳，并非每天太阳先出来、向日葵后转向，而是向日葵先朝向、而后才有太阳姗姗来迟。
生物钟的本质难以入手，研究不容易。人们用电生理方法研究而不得入门，年从果蝇的一个基因出发开启了生物钟的基因研究，23年后才发现哺乳动物第一个生物钟基因的突变，26年后明确哺乳类的生物钟基因与果蝇的类似，30年后才发现同果蝇一样的基因也控制人类生物钟。
驱动生物钟的内在机理随着一个一个基因的发现和研究，逐渐明朗，从果蝇到人存在同样一批控制生物钟的基因，它们编码的蛋白质合作共事，节律性地调节细胞内的基因转录，都采用了负反馈模式，并与光和温度等外界因素协调，从而对应于地球自转的近24小时节律。
研究生物钟最重要的六位科学家都在美国，其中五位研究果蝇，一位研究小鼠。加州理工学院的SeymourBenzer（-）和RonaldKonopka（-）开创生物钟的基因研究，发现第一个生物钟基因period（per）。两个团队克隆per基因：洛克菲勒大学的MichaelYoung（-）领导的实验室，Brandeis大学的MichaelRosbash（-）和JeffreyHall（-）两个实验室合作的团队，他们都还发现调控生物钟的更多基因。哺乳类生物钟基因研究的突破来自当时在美国西北大学、现在西南医学中心的JosephSTakahashi（高桥,-）。
一百多年来，科学家们因研究果蝇而获、、和年四次诺贝尔奖。如无意外，生物钟的研究将让果蝇再度引人瞩目。
生物钟的研究历程，出现过有趣和尴尬的故事？
生物钟的研究是否终结，没有重大问题、只剩细节了？
生物钟研究逾四十年，为何迄今尚未出现有效的应用成果？
行为研究的范式变化
生物钟可以看成一种行为模式。
行为是可以被其他动物和人类研究者所观察到的动物外在动作表现。行为研究的范式在年以前比较简单，以描述性为主。
因研究消化系统而获年诺奖的俄国科学家巴甫洛夫（IvanPavlov,-），后来却以条件反射的研究更为一般人所熟知。狗见到喜爱的食物会分泌唾液，而原本铃声不会诱导狗分泌唾液，但在铃声与食物多次同时出现后，单独出现铃声可以诱导狗分泌唾液，说明声音刺激与食物刺激之间可以建立联系。巴甫洛夫称食物为无条件刺激，铃声为条件刺激，对条件刺激的反应为条件反射。这种简单的行为学实验是20世纪初行为学的重要进展。
行为学既与生理学和神经生物学相关，也与心理学很近。美国的行为主义开创者JohnB.Watson（-）于发表《行为学主义者宣言》，提出人和动物的行为都很简单，由后天经历所塑造。年他用11个月的男孩Albert做实验，试图说明只要后天刺激建立他的恐惧行为，把他本不怕的鼠与铁棒声音偶联后，他见鼠和兔狗等其他动物都哭，认为这是条件反射塑造其行为。
美国著名心理学家B.F.Skinner（-）推广行为主义，提出所有动物和人一样，其行为都由后天刺激所塑造，是极端行为主义的代表。他发明了具体的实验设计：操作性条件反射。巴甫洛夫的条件反射只看动物的反应、不看其动作。Skinner用鸽子做实验，在鸽笼装两个钮，鸽子碰一个钮会得到吃的奖赏，触另一钮无奖。一段时间后，鸽子会经常去碰有奖钮，这种条件反射可以由它主动的行为表现出来，而不是流唾液这种被动反应，称为操作性条件反射，它迄今仍为研究学习记忆的重要模型。
年诺贝尔生理学或医学奖授予研究行为的科学家：奥地利的KonradLorenz（-）和KarlvonFrisch（-）、荷兰的NikolassTinbergen（-）。他们的研究既不是生理学、更不是医学，而是通过观察动物行为作出推论，接近十九世纪的博物学。
vonFrisch研究蜜蜂的行为，有多个发现如蜜蜂有内在的生物钟、有超乎人类的识别偏振光的能力。他得奖是因为发现蜜蜂通过舞蹈传送信息：一只蜜蜂发现食物后，飞回蜂巢告诉其他蜜蜂食物所在地的远近和角度、食物的多少。这是一个奇妙的社会行为，刺激科学界讨论动物是否合作、能否交流、以及语言是什么等问题。
Tinbergen的哥哥是年诺贝尔经济奖得主。Tinbergen研究动物的本能行为。本能的行为是天生（并不一定是幼年表现的）、到一定时候动物会表现的行为，比如生殖行为无需教导、也无需观察。Tinbergen和Lorenz发现动物有刻板动作，如一对鹅在交配后，公鹅要做一套特定动作；而一些刺激可以诱导特定动作，如有些特征可刺激鱼视之为敌而攻击。Lorenz也做过本能实验，但他更著名的研究是行为的印迹（imprinting）。他用灰腿鹅做实验，在刚从蛋孵化后一段时期内，如果小鹅见到的移动物体只是Lorenz本人，那么以后这些鹅视Lorenz为母亲，他走到哪里，它们跟到哪里，甚至长大后碰见真鹅，它们犹豫再三还是跟着Lorenz本人。印迹只能在特定时期产生，称为临界期。
年Tinbergen提出研究行为有四个方面，两个近端原因（proximatecauses）：发育（行为如何在个体发育过程中形成），机理（个体行为的原理）。两个终极原因（ultimatecauses）：进化，和功能（如打架为了抢配偶或食物）。
行为的研究现在都还有很多停留在描述的程度。如年vonBayern等的论文，描述乌鸦如何被迫用小石头帮助自己获得嘴巴够不着的食物。主要的行为学的教科书《动物行为学》超过这篇文章的内容也不多。
生物钟研究的突破缘于遗传学的应用。遗传学从孟德尔经摩尔根到年代初主要研究的核心是遗传的原理，揭示个体和群体的遗传规律。而年代末开始，遗传学作为重要的工具，提供研究生物现象的途径。通过突变观察到基因异常导致的表型，推论基因正常的功能，了解生物学机理。美国生物学家LelandHartwell（-）研究酵母细胞分裂的遗传突变，推论参与细胞分裂的基因，最后有助于理解人类的癌症。
通过异常现象了解正常规律，通过个别例外发现普适原理，是遗传学的核心之一。
生物钟的存在和意义
生物节律与其他节律一样，有震荡的幅度、周期、相位。
节律是生物钟的外在表现，生物钟是内在的定时机理。生物钟本身是自我维持的生理和行为节律发生器（pacemaker），可以受外界环境因素（zeitgebers）所导引、从而同步化。
生物有多种节律，不同的生物有着不同的节律，同一生物也有多种节律。有些动物每年一个周期的冬眠、有些植物每年一个周期的长叶落叶，动物还有更快的周期如呼吸和心跳…，而人们熟知的节律是昼夜节律。不仅大家熟悉的睡眠有昼夜节律，很多其他行为和生理指标也有昼夜节律。
公元4世纪，Androsthnenes知道罗望子树树叶的运动有昼夜差别（McClung,）。意大利的SantorioSantorio（-）前后30年记录自己从早到晚的摄食量、排泄量和体重变化，发现有昼夜规律。但他们未能区分外界影响的节律与生物自主的节律。年，法国天文学家JacquesOrtousdeMairan（-）用含羞草做材料，观察其叶片和花的变化，将它放置在全暗处一段时间，叶片仍然有张有合，不依赖阳光，但他当时没敢提出植物的昼夜节律是内在的（deMairan，；Szymanski，）。达尔文也研究过植物的节律，并提出昼夜节律的可遗传性（DarwinandDarwin，）。常见的向日葵好像围绕阳光的方向转向，但通过红外照相机可以看到向日葵朝向东方的行为早于日出，所以也是内在节律所驱动。昼夜节律并不依赖于地球自转：放到太空，节律照常（Sulzmanetal.,）。
Aschoff和Wever（）总结人的昼夜节律，德国大学生待在二战留下的堡垒中，灯光恒定、食物恒定、温度恒定、声音控制。在外界环境线索缺乏的情况下，人们仍然保持昼夜节律，只是在十几天后相位滞后。
现在知道，从简单的单细胞蓝绿藻（cynobacteria）细菌到多细胞的人，很多生物有生物钟的存在，但并不清楚是否所有地球上的生物都有昼夜节律。昼夜节律周期接近24小时（常见22至25小时）。在环境线索缺乏时可以继续维持，节律的相位由最后一次环境线索（如光、或温度等）所确定。在环境噪音中，节律照常运行。在一定范围内，节律周期并不随温度的改变而剧烈改变，有温度补偿机制，这不同于一般生化反应：如温度每上升10℃，酶的催化活性提高一倍。
昼夜节律的生物学意义目前仍不清楚。当然在进化过程中，生物活动与地球自转相匹配，也许可以节省能量、或提高效率。但如果没节律又会怎么样呢？蓝绿藻有昼夜节律，把正常的蓝绿藻与生物钟周期异常的细菌在一起长期培养，发现最后生物钟正常的细菌占了绝大多数，由此可见生物钟对生物体有利（Ouyangetal.,；Woelfleetal.,）。拟南芥的研究也观察到，周期缩短或延长的拟南芥，其固碳量、生长、存活都是与环境设定昼夜周期相吻合的拟南芥最适合，即：短周期突变株在20小时昼夜环境下生活得更好；而长周期突变株在28小时的模拟环境下更好（Doddetal.,）。这些观察，反映了只有当内外源周期保持一致时才最有利于植物生长。观察到周期正常有利于植物，不等于能够解释为什么，所以我们仍然是知其然、不知其所以然。
生物钟研究的新途径
怎么研究生物钟？
能看到动物、植物的变化，是外在表现，而不知道生物钟的核心：振荡发生器。
可以看到钟的长针、短针运动的轨迹，不等于理解了指挥它们运动的机械装置。
早期科学家用电生理研究生物钟，插电极到细胞观察电活动，曾观察到脑内特定部位SCN（视交叉上核，suprachiasmaticnucleus）的电活动有昼夜周期。用解剖学研究，可以了解哪个器官、组织、部位对于个体的生物钟至关重要。这一类研究中，在鸟类发现松果体很重要（GastonandMenaker，；ZimmermanandMenaker，），而哺乳类动物的主钟（masterclock）被认为是SCN。确定主钟的实验有三类，以SCN为例：损毁它导致动物失去昼夜节律（MooreandEichler，；StephanandZucker，）；将它加回损毁后的动物可恢复昼夜节律（Lehmanetal.,）；在捣毁后，移植其他动物的SCN，新节律与移植物来源的动物节律一样，例如，如果移植物来自周期22小时的动物，那么接受移植的动物周期也是22小时，而如果移植物来自周期20小时的动物，接受移植的动物也获得20小时的周期（Ralphetal.,）。
如果用遗传学研究生物现象，特别是用前馈遗传学（forwardgenetics）——随机筛选影响特定生物现象的突变——无需假设机理；这有别于通常采用的转特定基因、敲除特定基因的反向遗传学（reversegenetics）。这是遗传筛选的优点，但当时和现在都有人认为遗传筛选有很大的缺点：很多行为恐怕不是单个或几个基因所决定的，复杂的行为需要有很多基因参与，用遗传筛选对单个和少数基因有效，对更多基因参与的行为可能效果很差。
对于果蝇的行为，JerryHirsch就认为不能用单基因解释、也就不能通过遗传筛选的方法研究行为，只能同时改变很多基因进行代间选择来推断。而本哲（SeymourBenzer，-）认为果蝇的行为可以用突变单个基因的前馈遗传学来进行研究。年代，他们曾发生激烈争论，Hirsch甚至给本哲所在加州理工学院的每一个教授写信称本哲的研究是伪科学。
本哲
纽约出生的波兰犹太裔美国科学家本哲的大学是物理专业，年至年任教于普渡大学物理系，先研究过当时的热门：锗（Benzer,）。年他开始通过参加暑期课程、访问实验室来学生物。年转到生物系任教，研究分子生物学，有两个很重要的工作：遗传突变就是DNA碱基序列的变化（Benzer,）；基因的顺反子定义（Benzer,）。
本哲与果蝇模型。图片来源：wikipedia
在分子生物学做出诺贝尔程度的工作后，本哲与英国科学家、DNA双螺旋共同发现者FrancisCrick（-），南非犹太科学家、mRNA发现者SydneyBrenner（-）等认为，分子生物学的重要问题已解决、框架已建立，以后只有细节给后辈填空，而他们应该找下一个重要的领域。他们都选了神经生物学：Crick决定研究意识；Brenner决定需要新的模式生物研究神经生物学，他挑选了秀丽线虫，开发了线虫的遗传学，带出一批学生用线虫研究了发育生物学和神经生物学,虽然失去了mRNA应该获得的诺奖，但于年因为研究线虫获奖；本哲学习神经生物学后，决定用果蝇研究神经生物学。年，本哲转到加州理工学院，并开始发表果蝇行为的遗传学研究论文（Benzer，）。
本哲自年至年一直研究果蝇的行为。他转而研究神经生物学的初期，不仅同事笑他（研究脑袋愚蠢的果蝇，是不是研究者脑袋有毛病），而且“聪明”的学生一般不乐意跟他（你已经功成名就，不怕掉进陷阱，我们可年轻赔不起，不能舍命陪君子）。这一幕在他和Brenner身上都发生过。早期他们的学生要么不求功利、要么不懂生物、要么……总之大多都不是想安安稳稳的人。
结果，四十年中，本哲和他的学生们研究的很多方面都领先世界，包括学习记忆、性行为、离子通道、眼发育、人类神经退行性疾病的果蝇模型、痛等。他带出的几批学生和博士后成全世界神经生物学的重要一支。
本哲的分子生物学研究达到了诺奖程度，而他研究生物钟也明显达到诺奖程度。
偷懒是创新之母
年和年出现三篇文章，用遗传学研究生物钟。Konopka和Benzer（）发现影响果蝇生物钟的突变、Feldman和Wasar（）发现影响真菌（粗糙面包霉）生物钟的突变、Bruce（）发现影响绿藻生物钟的突变。突变是DNA序列的变化，位于特定基因内部、或者旁边的DNA变化，可能影响基因的功能。有突变就有基因，这是那以前的遗传学常识。
早在年就知道果蝇有生物节律。因为果蝇的研究者多，其研究工具多于真菌和绿藻。当然研究果蝇生物钟的科学家前赴后继也很重要。最终，果蝇的研究对生物钟的理解起到的推动作用不仅多于真菌和绿藻，也多于其他任何生物。
生物钟的课题为当时还是研究生的RonaldKonopka（-）所提出（Rosbash，），在本哲用遗传研究行为的总体框架之中。
RonaldKonopka（-）
遗传筛选的实验设计是：建立检测表型的方法，用致变剂诱导特定生物的不同基因发生突变，检测不同突变种的表型。具体到果蝇的生物钟，就应该是建立检测生物钟的方法，用化学诱变剂诱导不同基因突变，然后一只一只检测果蝇，以便发现改变了昼夜节律的突变种。
当时没人知道果蝇有约两万个基因，化学分子诱发随机突变，只做两万只果蝇不够，其中部分突变在相同基因，所以应该加几倍，才可能大部分基因都突变过一次。因行为有漂移，一个基因的突变种，不能仅检测一只果蝇，应该检测几只到几十只。果蝇是二倍体，每个基因有两套，一套坏了可以被另一个等位基因所代偿，所以最好不要做子一代（F1）的筛选，而最好是F2代，传代后再筛选，而F2代只有四分之一是同一基因突变的纯合子那么需要筛选的数量应一两百万，才算做过全基因组的筛选。
检测果蝇昼夜节律的标准方法，是将单只果蝇放到透明的管中，管子只容一只果蝇来回走动。一束光射过小管的中央，凡是果蝇走过管中央，计算机就记录果蝇运动了一次。以此检测果蝇活动的变化，发现确实有昼夜规律。如检测很多果蝇，工作量比较大。
Konopka和Benzer用了两个偷工减料方法来加快速度。其一是果蝇遗传学特有的attachedX，可以快速检测X染色体的突变。其二是他们决定不筛选昼夜节律，而筛另一节律：果蝇羽化。果蝇受精卵成为胚胎，发育成为幼虫，三次蜕皮后成为蛹，蛹经过羽化成为成虫。
昼夜活动节律是果蝇成虫每天经历一次、几十天周而复始的循环。而果蝇一生仅羽化一次。羽化一般在黎明前，最迟也在上午。三十年代到五十年代的研究明确提出羽化为独立于温度的生物钟所控制（Kalmus，，a，b，Pittendrigh，）。但是，一生一次的羽化的生物钟与成虫每天的活动生物钟，是否有关，当时并不清楚。
Konopka觉得羽化作为筛选方法很容易操作。用单只果蝇做经典的昼夜活动规律检测比较慢。如果用羽化作为筛选方法，就很便当：化学诱变处理得到各种突变的果蝇猴，Konopka每天上午不来上班，午后到实验室把所有羽化的果蝇倒掉，留下其他蛹，下午到晚上再羽化的就是影响节律的突变种，因为它们的羽化时间不同于正常（所谓“野生型”）果蝇。这样的方法大大简化了检测、加速了筛选。
偷懒，依赖人脑的偷懒，（有时）是创新之母。
生物钟研究的突破
对于一个研究生来说，用如此简单的方法，不难筛选几万只、几十万只、几百万只果蝇。但Konopka只筛选了不到两百种品系的果蝇就得到第一个突变品系，继续筛选不到两千种品系的果蝇再得到两个突变品系。
他们用羽化筛到突变品系后，更重要的是用标准检测运动的昼夜节律之方法看个体的昼夜活动是否变化，结果发现确实突变果蝇的运动昼夜节律异常。有趣的是，他们发现的三种品系的突变果蝇在表型上并不相同：一种没有节律，一种节律周期长短加快到19小时，一种节律变慢到28小时。他们进一步将突变种与已有的其他突变交配，确立三种突变在染色体图谱的大概位置，结果发现很近，他们进一步把三种突变相互交配，进行本哲发明的顺反检测，试图确立它们是否同一基因，他们根据得到的结果推测三种突变可能是同一个基因的不同突变。他们把这个基因命名为period（简写per），无节律的为per0（perzero）、节律短的为pers（pershort）、节律长的为perl（perlong）。这里需要说明，他们进行的顺反检测并不严格，只做了反位（trans）的检测没做顺位（cis）的检测，所以只从年的文章不能完全断定三个突变是否同一基因，虽然当时的结果支持这一可能。
他们筛选的果蝇数量不多，却得到了一个基因的三种不同方向的突变，因此显得特别有运气。
各种筛选和检测生物钟的方法，都有可能在一些非生物钟关键的基因导致的突变而有所影响。同一个基因可以出现三个方向的突变，不仅是运气，而且对于这个基因的功能也提供了很好的支持：很难设想不参与驱动生物钟的基因可以导致三个不同方向的突变表型。如果三个突变确为一个基因的三种突变，那么per基因很可能是生物钟的关键基因之一。
本哲于年代末期学生物的老师、年诺奖得主、德国物理学家转为美国生物学家的MaxDelbrück（-），这时也在加州理工学院，他听本哲说结果后，并不信找到了生物钟的基因：
MaxDelbrück:“Idon’tbelieveit”
Benzer:“ButMax,wefoundthegene!”
Delbrück:“Idon’tbelieveawordofit.”
克隆per基因：竞争的好处
年，因为技术缺乏，不可能得到per基因的DNA（“克隆基因”）。重组DNA技术于年才发明，而克隆果蝇DNA的技术还要等到年在斯坦福大学的DavidHogness和加州理工学院的TomManiatis等人的工作推动下才能进行。待所有技术都成熟以后才开始研究较容易，也容易成为跟风；不待技术成熟就开始研究是开拓，但有很大的危险，如果领先几十年，可能开拓者一生也用不上。
年代是基因克隆的烽火连天时代。两个团队竞争克隆果蝇的per基因：洛克菲勒大学的MichaelYoung（杨迈克）；Brandeis大学的JeffreyHall（霍尔）与MichaelRosbash（罗斯巴希）。杨迈克是研究果蝇出身，博士后的老师为克隆果蝇DNA的先驱DavidHogness。霍尔是本哲的博士后，懂果蝇，到Brandeis后与分子生物学专长的同事罗斯巴希合作。这些科学家都还有其他研究课题，杨迈克同时在与耶鲁大学的希腊裔生物学家SpirosArtavanis-Tsakonas竞争克隆Notch基因，霍尔还在研究果蝇性行为的fruitless基因，罗斯巴希多年用酵母研究mRNA剪接机理。
左起分别为，迈克尔·杨（MichaelWYoung）、杰弗理·霍尔（JeffreyCHall）、迈克尔·罗斯巴希（MichaelRosbash），三人曾获得年第十届邵逸夫奖生命科学与医学奖。
年，杨迈克和霍尔—罗斯巴希两个团队都拿到Per基因附近的基因组DNA（BargielloandYoung，；Reddyetal.,;Zehringetal.,）。这段DNA可以产生4.5kb和0.9kb两种mRNA，所以可能对应两个基因。霍尔—罗斯巴希组观察到0.9kb之mRNA的含量有昼夜变化（Reddyetal.,;Zehringetal.,），认为相应的DNA为per基因。杨迈克认为4.5kb对应的基因是Per基因。后来两个团队都确认4.5kb对应的是per基因（Bargielloetal.,；Hamblenetal.,;Lorenzetal.,）。将编码4.5kbmRNA的基因组DNA转入果蝇，可以使per突变种果蝇的昼夜节律恢复正常。进一步发现改变导入的per基因表达的相位可改变果蝇昼夜节律的相位（Ederyetal.,）。
在两个团队的竞争过程中，一个组出现错误（霍尔—罗斯巴希组最初错认了per基因），被另外一个组纠正，这是竞争对科学界的好处。
两组科学家都确定了per基因在最初三种突变株的DNA变化：per0、pers、perl分别是提前终止、和两个不同部位的碱基变化（Bayliesetal.,;Yuetal.,a）。
霍尔—罗斯巴希组的中国留学生俞强还发现，缺失per蛋白质特定一段区域，昼夜活动节律不受影响，只影响求偶时果蝇翅膀有节律的歌唱（Yuetal.,b）。霍尔实验室在年发现果蝇求偶时的翅膀振荡有节律（KyriacouandHall，），其后有争议，近年有人正式提出商榷（Stern,;Kyriacouetal.,;Sternetal.,）。
霍尔—罗斯巴希组早期参与生物钟研究的中国留学生有：复旦大学本科毕业的俞强，北京医学院的刘欣（Liuetal.,,），复旦的*佐石（Huangetal.,），武汉大学的曾红葵（Zengetal.,）。
per的功能：竞争的坏处
拿到基因，令人鼓舞。
但是，拿到基因不一定就能够立即知道机理。正如测序人类基因组只是工具，而不是美国总统等*治人物在一些羞耻感比较弱的科技工作者诱导下称测序人类基因组就是揭示人类奥秘。今天对人类的奥秘还远远不清楚，单纯测序本身也没有自动解开人类奥秘。
同理，拿到了per基因的DNA，并不知道它所编码产生的蛋白质的功能，也不能推导出生物钟的机理。有时，拿到基因后很长时间都不能理解其功能，也就不能理解生物学过程或者人类疾病的机理。比如，莱－尼（Lesch-Nyhan）综合征，病人自残，是很特殊的疾病，其基因已经知道多年，编码HGPRT（次*嘌呤磷酸核糖转移酶），是核酸代谢的一个酶，但知道基因、知道蛋白质都不能告诉我们为什么病人会自残，也不能告诉我们有残害他人能力的人们绝大多数都不会自残的生理学原因。
要推出基因编码蛋白质的功能，如果其预计的氨基酸序列与其他某种蛋白质有相似性，那么功能就可能相似，从而可以提供研究的着手点。两个组都看到per蛋白质有部分序列是重复的，杨迈克实验室还以为它相似于小鼠的序列（Shinetal.,），后来发现并非如此。
年，两个课题组都发表文章称per蛋白质是蛋白多糖（Jacksonetal.,;Reddyetal.,）。这次两个课题组都错了，竞争的课题组错成一样是咄咄怪事。
年，杨迈克课题组与爱因斯坦医学院的DavidSpray实验室合作，进一步发表文章（Bargielloetal.,），称Per影响了细胞间交流（提示per可能起缝隙连接相关的功能，比如缝隙蛋白），这一结果很可能是从猜测per是蛋白多糖——可能是膜蛋白——所以可能是缝隙蛋白的潜意识造成。但这一结果不能重复，年杨迈克和Spray合作团队不得不道歉并收回年令人瞩目的《自然》文章（Saezetal.,）。霍尔—罗斯巴希组于年也发表文章说明Per不参与细胞间连接（Flintetal.,）。
从至，在激烈竞争的过程中，两个课题组都错了两次：各自分别错了一次，同时错了一次。同一项研究错过两次的比较少，出一样的错不免尴尬。
permRNA：仔细不是坏事
克隆获得了基因，再看基因的表达是自然的延伸。
分子生物学的“中心法则”：DNA—RNA—蛋白质。DNA承载遗传信息，可以复制和遗传；在DNA指导下，遗传信息转录为信使核糖核酸（mRNA）；在mRNA指导下合成蛋白质，蛋白质再起各种功能。不同基因转录产生不同mRNA、得到不同蛋白质，产生不同功能。
检测基因表达可以检测mRNA的表达，也可以检测蛋白质的表达。一般来说，一个动物的大部分细胞含有同样的DNA，而含有不同的mRNA和蛋白质。霍尔—罗斯巴希组、杨迈克组都检测per的mRNA和蛋白质表达在什么时间和空间（Jamesetal.,；SaezandYoung,；Liuetal.,；Siwickietal.,；Zerretal.,；Liuetal.,），其中费了很大的劲制造per蛋白质的抗体，因为mRNA只能抗基因表达的区域和细胞，帮助理解哪些区域和细胞可能是果蝇的生物钟。但mRNA不能看到其产物蛋白质所在的亚细胞定位，而抗体可以识别蛋白质而确定per蛋白质在细胞内的位置。per蛋白质好像既可以存在于细胞核、也可以存在于细胞质（SaezandYoung，；Siwickietal.,）。到年，刘欣的文章才确认per蛋白质存在于细胞核（Liuetal.,）。
既然per基因参与昼夜节律，那么per的基因表达（mRNA或者蛋白质）是否也有时间调控，例如昼夜差别？年，霍尔—罗斯巴希组提出per的蛋白质有昼夜变化（Siwickietal.,）。per的mRNA是否有昼夜变化？理论上，研究RNA变化比研究蛋白质容易，因为不依赖于获得好的抗体，而只要得到基因的DNA就很快可以通过普通的分子生物学方法研究mRNA的表达。但最初未见per的mRNA昼夜变化。一个可能是做实验的人技术不好、或不仔细，一个可能是偶然的：传说最初检测permRNA的人，是从果蝇全身获得RNA，只分昼夜时间、不分身体部位。而出现突破的年，是从果蝇头部提取RNA，避免其他部分（如腹部）所含RNA掩盖了头部mRNA。
为什么需要专门研究头里的per基因?这与昼夜节律的关键部分存在于身体什么部位有关。在得到per基因突变后，Handler和Konopka专门在不同突变型的果蝇之间进行局部细胞的移植，以便确定哪个部位起决定性作用。从pers果蝇取得脑组织，移植到per0果蝇腹腔中，发现per0变成了pers，显示脑确定节律（HandlerandKonopka，）。年，离开加州理工学院在Clarkson大学的Konopka等再用遗传嵌合体做实验，让果蝇部分区域的细胞含突变的per（如pers），而其余部分仍然正常，结果发现：如果脑含pers，果蝇的生物钟就变短（Konopkaetal.,）。所以，移植实验和嵌合体实验皆支持per基因在脑中控制全身的昼夜节律。
年，霍尔—罗斯巴希组的博士后PaulHardin终于每个小时取果蝇的头得到mRNA，再检测per的mRNA，发现它呈昼夜变化（Hardin，Hall，Rosbash，）。在pers中，per的mRNA昼夜周期也缩短。他们提出简单的模型：per的基因转录per的mRNA、翻译产生per蛋白质的过程存在负反馈，per的mRNA或蛋白质产生后，可以影响per基因自身的转录。他们当时不能排除per调节昼夜节律这一行为之后，行为再通过更复杂的反馈作用于per基因转录。这里需要用Occam剃刀原则，既首先检测最简单的可能性。这一简单解释提供了生物钟机制的理论突破，是迄今为止仍被公认的“转录—翻译负反馈环路（transcription-translationfeedbackloop,TTFL）”的基础，罗斯巴希称赞提出这一模型的博士后Hardin。
如果这一假设正确，那么per蛋白质就是基因的转录调节因子。而对于转录因子，年代有很多进展，从而可以为研究per和生物钟的机理提供很好的借鉴。
不久，霍尔—罗斯巴希组的Zerr又用抗体检测提出per蛋白质的表达，在部分脑区也有昼夜节律，这种节律的长短也被per本身所调节，因为在生物钟缩短的果蝇突变种pers中，per的蛋白质昼夜周期也缩短（Zerretal.,）。mRNA的昼夜节律与蛋白质昼夜节律之间有一定的间隔，也就是相位不同。几年之后知道不仅per蛋白质含量变化，而且其亚细胞定位变化：昼夜周期中，per蛋白质进入细胞核的时间有昼夜周期变化（Curtinetal.,）。
基因转录调控
年，研究果蝇生物钟的Hardin等提出per蛋白质可能调节基因转录，依据的是间接证据。
年和年，其他途径的研究发现了几个与per有相似性区域的蛋白质。研究果蝇胚胎发育的Crews实验室发现一个基因singleminded（sim），其缺失导致果蝇胚胎腹侧中线的神经细胞缺乏（Nambuetal.,）。研究环境致癌物的Hoffman等和Burbach等，发现一个被致癌物二恶英(dioxin)作用的受体AhR（Hoffmanetal.,；Burbach,Poland,Bradfield,）。per、AhR和sim三个蛋白质都相似的区域称为PAS区域。
因为AhR确定是转录因子，而且有专门调节转录的区域bHLH，所以提示per和SIM也是转录调节因子，但per缺AhR具有的转录调节区域，只有PAS区域。年，罗斯巴希实验室的*佐石证明，PAS区域是蛋白质—蛋白质相互作用区域，PAS和PAS可以偶聚化（Huang,EderyandRosbash，）。进一步研究提出，具有bHLH和PAS区域的蛋白质可能是转录激活因子，而只有PAS但缺乏bHLH的per蛋白质不能激活转录但可以抑制能够激活转录而同时有bHLH和PAS区域的蛋白质（Lindebro,PoellingerandWhitelaw，）。
Hardin自己独立实验室后，证明per蛋白质调控per基因转录，依赖于per基因在蛋白质编码区域之上游（分子生物学称为5’端）的DNA序列（Hao,AllenandHardin,）。以后有更多证据表明，per参与转录调节，而且与多个基因有关。
更多参与果蝇生物钟的基因
影响生物钟不可能只有一个基因。
年发现第一个影响果蝇生物钟的基因per。
年，Jackson发表了影响果蝇生物钟的其他基因（Jackson，），但无果而终。
年，霍尔—罗斯巴希组发表“新”的果蝇昼夜节律基因“钟”（Clock）（Dushayetal.,），不够他们于年发现这不是新的基因而仅为per基因的另一突变而已（Dushayetal.,），辛勤努力化为一江春水。
年Konopka等发表第二个影响果蝇生物钟的基因Andante（Konopka,SmithandOrr，）。注意这一基因的人不多，到年它才被Tufts大学的RobJackson实验室所克隆（Aktenetal.,）。
年洛克菲勒大学杨迈克实验室的Sehgal等在会议上报道她们筛选影响果蝇生物钟的新基因（Sehgaletal.,）。
年，杨迈克实验室报道他们发现了timeless基因（“无时间”，简称Tim），这次Seghal等通过筛选7千多个突变种找到第三个影响果蝇生物钟的新基因（Seghaletal.,）。他们用了转座子插入诱导突变，以利克隆基因，而最初的检测也是羽化，其后用活动节律核实确实影响了昼夜节律。她们还发现tim的突变也影响per的RNA昼夜变化，所以与per基因相关。杨迈克实验室的研究生LeslieVosshall发现Tim影响Per蛋白质出入细胞核（Vosshalletal.,）。
杨迈克实验室很快克隆到tim基因（Myersetal.,）。虽然预计的tim蛋白质序列看不出它是怎么作用的蛋白质，但因为它可以结合per，那么估计也是转录因子。罗斯巴希实验室的研究生曾红葵发现tim与per两个蛋白质的相互作用有昼夜节律，而光可以调节tim蛋白质的稳定性，从而提供了光对生物钟的调节的分子机理（Zengetal.,）。
调节其他生物昼夜节律的基因
多种生物，从细菌、植物到包括人在内的动物，都有节律、有昼夜节律。存在于多种生物的生物钟，是否用同样的分子？是否用同样的机理？
粗糙面包霉（neurospora）的生物钟基因Frequency（frq，“频率”）于年被克隆，当时以为它与per有部分序列相似（McClung,Fox,Dunlap，），后来发现不相似。
控制有些细菌生物钟的基因也纷纷被克隆（如，Liuetal.,）。
年，调节植物（如拟南芥）生物钟的基因被克隆（Millaretal.,）。
很多人关心的是：哺乳类的生物钟，用什么基因？
千呼万唤始出来：哺乳动物的生物钟基因
调节哺乳动物生物钟的第一个基因tau的突变种于年被偶然发现（RalphandMenaker，），但基因克隆需要等到年（Lowreyetal.,），它编码一个蛋白激酶（CKIε）。
在克隆了果蝇per基因的年至年，有很强烈的希望找到哺乳类生物钟基因，明显应找类似per的基因，但这一途径费尽九牛二虎之力，并无显著成果。曾找到了蚕的per基因（Reppertetal.,），但它无助于找哺乳类的per。
时代呼唤英雄，找到哺乳类生物钟基因的英雄。
在美国芝加哥北郊西北大学工作的日裔科学家高桥决定不再依赖容易的方法，而用老鼠做遗传筛选。
果蝇很小、生活周期短，方便且便宜。用要贵很多。如果通过筛选找基因，那么除了如果蝇一样算数量，还要考虑经费。为了在一定范围省时间和经费，高桥实验室不筛选纯合体突变种，而筛杂合体。不过筛杂合体虽然省了工作量，但也降低了突变检出率。即使这样，也需要超过十万只的老鼠才能筛一遍。有个笑话：做这种实验，类似把豪华旅馆献给老鼠。
年，可能世界上没一个实验室认为自己有足够的经费。很可能用完了经费还找不到影响老鼠生物钟的基因，所以没人敢做。
高桥带领实验室是发愤图强、还是铤而走险?
他们的勇气遇到了运气。他们当时一共只研究了只小鼠，第25只就是影响生物钟的突变体，他们从而发现了影响老鼠生物钟的基因，他们命名为“钟”（Clock）（Vitaternaetal.,）。正常老鼠生物钟的周期是23.7小时，Clock杂合的突变鼠昼夜节律为24.8，变化可谓微妙，需要可靠的检测才能发现。从杂合体检测出微小但可靠的变化后，高桥实验室很容易通过交配小鼠而获得Clock基因突变的纯合体，其表型很强：完全丧失节律。
年，高桥实验室在《细胞》杂志发表两篇论文，报道他们克隆的老鼠Clock基因（Kingetal.,；Antochetel.,）。
老鼠Clock蛋白质不仅有与蛋白质相互作用的PAS区域，而且有直接结合DNA的bHLH区域（Kingetal.,），从而更容易理解它如何调节基因转录。Clock基因本身也表达于SCN。他们还发现人、鸡、蜥蜴、蛙、鱼也有Clock基因（Kingetal.,）。
果蝇与哺乳类是否有类似的分子机理？
如果果蝇的per基因只是在果蝇和昆虫起作用，那么意义就有限。如果找到高等动物的Per并因此开启研究高等动物生物钟的分子机理，那么意义就较大。
果蝇的per基因在年被克隆后，长期有人（如麻省大学伍斯特校区的StevenReppert）试图在高等动物中找到Per基因，但无果。一般来说，一个基因在低等动物中发现后，在高等动物中比较容易找到，有多种方法可以通过DNA序列相似性找到。找不到有几种可能：Per在高等动物不存在，例如果蝇的生物钟可能高等动物的生物钟不同，也可以是果蝇和高等动物生物钟大体类似但其中有分子不同（如果蝇用per但高等动物不用）；另一可能是研究者技术上的问题，在高等动物存在Per基因，但未被找到。从年到年的努力都找不到哺乳动物的per基因的情况下，很多人灰心地认为恐怕哺乳类无Per。
年，两个实验室歪打正着，找到老鼠和人的Per（Teietal.,；Sunetal.,）。美国华人科学家在研究其他问题的时候，发现一个基因与per有序列相似性（Sunetal.,）。比较它们后知道，以前没找到的原因是哺乳类的Per与果蝇的per基因在整个基因的相似性不很高，而局部很高。以前用整体去找很难找到，而用局部的困难在当时并不知道哪段是保守的。
哺乳类的Per基因有三个：Per1、Per2、Per3（Shearmanetal.,），Per基因表达在SCN（Shearmanetal.,），其表达随昼夜节律变化而变化，这一节律受Clock基因的调节（Jinetal.,）。
年，霍尔—罗斯巴希组通过遗传筛选，也在果蝇找到Jrk基因，发现就是果蝇的clock基因（Alladaetal.,）。有趣的是，SteveKay实验室发现clock蛋白可以激活带有per基因启动子片段E-box驱动的荧光素（luciferase）报告基因的表达，这一激活能被per自身所抑制，从而较好地实现负反馈环路的闭合（Darlingtonetal.,）。
首先在果蝇发现的per基因终于在哺乳类找到了，而首先在老鼠发现的基因Clock也在果蝇中发现了，从昆虫到哺乳类，生物钟的基因看来高度保守。这虽然是基因水平，但提示机理也保守。
果蝇遗传筛选对生物钟研究的重要性
在生物钟的基因研究过程中，果蝇一马当先，科学家从中发现了per（KonopkaandBenzer，）、andante（Konopka,SmithandOrr，）、tim（Sehgaletal.,,）。
用果蝇研究生物钟，在速度、价格、工作量上都优于哺乳类。用细菌、真菌、植物研究生物钟，也可以有这些优势，但它们的生物钟基因与动物的不同，研究它们不能揭示哺乳类的生物钟机理。
当然，在从各种生物得到答案之前，人们无法预料生物钟的机理保守的范围。但事后可以总结果蝇对于生物钟研究的重要性。
并非所有低等生物的研究都适用于高等生物，有些相通、有些不同。例如：细胞周期的原理从酵母到人都保守，而性别确定的机理从果蝇到人类并不保守。虽然研究低等生物特有的生物学原理也有科学意义，但人偏于